|
产品名称 |
产品编号 |
规格 储存 |
|
Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) |
PH |
50 μL (200 U/μL) -20℃ |
|
5 X M-MLV buffer |
PHb |
1 mL -20℃ |
|
10 mM dNTP |
PHd |
250 μL -20℃ |
|
Oligo (dT)18 (50 μM) |
PH |
250 μL -20℃ |
|
Random Primers N6 (25 μM) |
PHb |
250 μL -20℃ |
|
RNase Inhibitor |
PHd |
125 μL (40 U/μL) -20℃ |
|
RNase free ddH2O |
PHd |
1 mL x 2 -20℃ |
产品描述：
LSC ® I 1st Strand cDNA Synthesis Kit 是基于LSC ® I Reverse Transcriptase 开发的反转录试剂盒。具有较好的热稳定性，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA 模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。
试剂盒中包含由总RNA 或mRNA 合成高质量第一链cDNA 所需的所有成分，并提供两种cDNA 合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)18，合成的单链cDNA 产物可直接用来进行后续PCR 或者qPCR 反应。
第一链cDNA 合成操作步骤 （10μL）
1) 离心管中配制下列模板RNA/引物混合液，总量6 μL。
|
组分 |
使用量 |
|
模板RNA 引物1（10 μM） |
1 ng-1 μg*
|
|
Oligo (dT)18（50 μM）a |
1 μL |
|
或Random Primers N6 (25 μM) b
|
|
|
或 Gene Specific Primers (10 μM) |
|
|
RNase free ddH2O |
to 6 μL |
* Total RNA的使用量一般为1 ng-1 μg；mRNA的使用量一般为10 pg-1 μg。
a 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18 ，与真核生物mRNA 的3’ Poly A 尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
b 原核生物RNA的逆转录建议选择Random Primers N6 或者Gene Specific Primers，Random Primers N6 适用性较广，mRNA、rRNA、tRNA、small RNA 和LncRNA 等模板均可用Random Primers N6 进行。
2) 70℃ 保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
3) 离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。
4) 在上述离心管中配制下列逆转录反应液。
|
组分 |
使用量 |
|
上述模板RNA/引物变性溶液 引物1（10 μM） |
6 μL |
|
5 X M-MLV buffer |
2 μL |
|
10 mM dNTP |
0.5 μL |
|
RNase Inhibitor (40 U/μL) |
0.25 μL
|
|
M-MLV (200 U/μL) |
0.25 -1 μL*
|
|
RNase free ddH2O |
to 10 μL |
* 当起始模板RNA量＞500 ng时，M-MLV的使用量应＞0.25 μl。
5) 42℃保温1小时*。
* 以Random Primers作为反转录引物时应先进行30℃，10分钟反应，然后再在42℃条件保温1小时。
6) 70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时建议cDNA溶液稀释5倍后使用。
